熒光定量PCR檢測技術(shù)誕生至今已10多年的時(shí)間，而其應用一直都沒(méi)廣泛展開(kāi)，究其原因，無(wú)外乎受制于相關(guān)儀器、試劑和技術(shù)的發(fā)展。近期，尤其是08年以來(lái)，儀器和試劑是遍地開(kāi)花，這也使科研人員均躍躍欲試，都想借此技術(shù)使自己的研究能突飛猛進(jìn)，發(fā)展勢頭通過(guò)查找每年所發(fā)表的文章數可一目了然。據有關(guān)統計，在 Medline 數據庫中，用“Taqman” 或 ”real time PCR” 作為關(guān)鍵詞檢索，1996 年是19 篇，1999 年157 篇，到2003 年就高達2984 篇，2009年會(huì )是多少呢？我們不得而知。但其迅猛的發(fā)展勢頭卻是不可更改的，本公司真誠希望能和眾多研究人員共同努力，抓住這一大好時(shí)機，為科研事業(yè)的發(fā)展貢獻自身的力量?；谶@一目標，本公司長(cháng)期以來(lái)對熒光定量PCR，無(wú)論是技術(shù)還是多年來(lái)的產(chǎn)品，均進(jìn)行了深入地研究，并及時(shí)推出更加優(yōu)異的熒光定量 PCR技術(shù)服務(wù)。

熒光定量PCR原理

熒光定量PCR最早稱(chēng)TaqMan PCR，后來(lái)也叫Real-Time PCR，是美國PE(Perkin Elmer)公司1995年研制出來(lái)的一種新的核酸定量技術(shù)。該技術(shù)是在常規PCR基礎上加入熒光標記探針或相應的熒光染料來(lái)實(shí)現其定量功能的。其原理：隨著(zhù)PCR反應的進(jìn)行，PCR反應產(chǎn)物不斷累計，熒光信號強度也等比例增加。每經(jīng)過(guò)一個(gè)循環(huán)，收集一個(gè)熒光強度信號，這樣我們就可以通過(guò)熒光強度變化監測產(chǎn)物量的變化，從而得到一條熒光擴增曲線(xiàn)圖。

一般而言，熒光擴增曲線(xiàn)可以分成三個(gè)階段：熒光背景信號階段，熒光信號指數擴增階段和平臺期。在熒光背景信號階段，擴增的熒光信號被熒光背景信號所掩蓋，無(wú)法判斷產(chǎn)物量的變化。而在平臺期，擴增產(chǎn)物已不再呈指數級的增加，PCR 的終產(chǎn)物量與起始模板量之間沒(méi)有線(xiàn)性關(guān)系，根據最終的 PCR 產(chǎn)物量也不能計算出起始 DNA 拷貝數。只有在熒光信號指數擴增階段， PCR產(chǎn)物量的對數值與起始模板量之間存在線(xiàn)性關(guān)系，我們可以選擇在這個(gè)階段進(jìn)行定量分析。為了定量和比較的方便，在實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 技術(shù)中引入了兩個(gè)非常重要的概念：熒光閾值和 CT值(如下圖所示)。

熒光域值(threshold)

是在熒光擴增曲線(xiàn)上人為設定的一個(gè)值，它可以設定在熒光信號指數擴增階段任意位置上，但一般熒光域值的缺省設置是PCR反應前3-15個(gè)循環(huán)熒光信號標準偏差的10倍，即：threshold。

Ct值與起始模板的關(guān)系：

研究表明，每個(gè)模板的Ct值與該模板的起始拷貝數的對數存在線(xiàn)性關(guān)系，起始拷貝數越多，Ct值越小。利用已知起始拷貝數的標準品可作出標準曲線(xiàn)，其中橫坐標代表起始拷貝數的對數，縱坐標代表Ct值如下圖所示。因此，只要獲得未知樣品的Ct值，即可從標準曲線(xiàn)上計算出該樣品的起始拷貝數。

熒光定量檢測

熒光定量檢測根據所使用的標記物不同可分為熒光探針和熒光染料。熒光探針又包括Beacon技術(shù)(分子信標技術(shù)，以美國人Tagyi為代表)、 TaqMan探針(以美國ABI公司為代表)和FRET技術(shù)(以羅氏公司為代表)等；熒光染料包括飽和熒光染料和非飽和熒光染料，非飽和熒光染料的典型代表就是現在最常用的SYBR GreenⅠ；飽和熒光染料有EvaGreen、LC Green等。

嵌合熒光染料法(SYBR GreenⅠ)

SYBR Green I是熒光定量PCR最常用的DNA結合染料，與雙鏈DNA非特異性結合。在游離狀態(tài)下，SYBR Green I發(fā)出微弱的熒光，但一旦與雙鏈DNA結合，其熒光增加1000倍。所以，一個(gè)反應發(fā)出的全部熒光信號與出線(xiàn)的雙鏈DNA量呈比列，且會(huì )隨擴增產(chǎn)物的增加而增加。

SYBR Green I熒光染料與DNA雙鏈的結合

雙鏈DNA結合染料的優(yōu)點(diǎn)：實(shí)驗設計簡(jiǎn)單，僅需要2個(gè)引物，不需要設計探針，無(wú)需設計多個(gè)探針即可以快速檢驗多個(gè)基因，且能夠進(jìn)行熔點(diǎn)曲線(xiàn)分析，檢驗擴增反應的特異性，低的初始成本，通用性好，因此國內外在科研中使用比較普遍。

熒光探針?lè )?Taqman 技術(shù))：PCR擴增時(shí)，加入一對引物的同時(shí)再加入一個(gè)特異性的熒光探針。該探針為一直線(xiàn)型的寡核苷酸，兩端分別標記一個(gè)熒光報告基團和一個(gè)熒光淬滅基團，探針完整時(shí)，報告基團發(fā)射的熒光信號被淬滅基團吸收，PCR 儀檢測不到熒光信號； PCR擴增時(shí)(在延伸階段)，Taq 酶的 5' － 3' 切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離，從而熒光監測系統可接收到熒光信號，即每擴增一條 DNA 鏈，就有一個(gè)熒光分子形成，實(shí)現了熒光信號的累積與 PCR 產(chǎn)物形成完全同步，這也是定量的基礎所在。其過(guò)程如下圖所示

熒光定量PCR的應用

分子生物學(xué)研究

1 核酸定量分析。對傳染性疾病進(jìn)行定量定性分析，病原微生物或病毒含量的檢測 , 比如近期流行的甲型H1N1流感， 轉基因動(dòng)植物基因拷貝數的檢測，RNAi 基因失活率的檢測等。

2 基因表達差異分析。比較經(jīng)過(guò)不同處理樣本之間特定基因的表達差異(如藥物處理、物理處理、化學(xué)處理等) ，特定基因在不同時(shí)相的表達差異以及cDNA芯片或差顯結果的確證

3 SNP 檢測。檢測單核苷酸多態(tài)性對于研究個(gè)體對不同疾病的易感性或者個(gè)體對特定藥物的不同反應有著(zhù)重要的意義，因分子信標結構的巧妙性，一旦SNP 的序列信息是已知的，采用這種技術(shù)進(jìn)行高通量的 SNP 檢測將會(huì )變得簡(jiǎn)單而準確。

4 甲基化檢測。甲基化同人類(lèi)的許多疾病有關(guān)，特別是癌癥， Laird 報道了一種稱(chēng)作 Methylight的技術(shù)，在擴增之前先處理 DNA ，使得未甲基化的胞嘧啶變成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不受影響，用特異性的引物和 Taqman探針來(lái)區分甲基化和非甲基化的 DNA ，這種方法不僅方便而且靈敏度更高。

醫學(xué)研究

5 產(chǎn)前診斷：人們對遺傳性物質(zhì)改變引起的遺傳性疾病還無(wú)法治療，到目前為止，還只能只能通過(guò)產(chǎn)前監測，減少病嬰出生，以防止各類(lèi)遺傳性疾病的發(fā)生，如為減少X連鎖遺傳病患兒的出生，從孕婦的外周血中分離胎兒DNA，用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測其Y性別決定區基因是一種無(wú)創(chuàng )傷性的方法，易為孕婦所接受。

6 病原體檢測：采用熒光定量PCR檢測技術(shù)可以對淋球菌、沙眼衣原體、解脲支原體、人類(lèi)乳頭瘤病毒、單純皰疹病毒、人類(lèi)免疫缺陷病毒、肝炎病毒、流感病毒、結核分枝桿菌、EB病毒和巨細胞病毒等病原體進(jìn)行定量測定。與傳統的檢測方法相比具有靈敏度高、取樣少、快速簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)。

7 藥物療效考核：對乙型肝炎病毒 (HBV)、丙型肝炎病毒 (HCV) 定量分析顯示：病毒量與某些藥物的療效關(guān)系。HCV高水平表達，干擾素治療作用不敏感，而HCV低滴度，干擾素作用敏感；在拉米夫定治療過(guò)程中，HBV- DNA的血清含量曾有下降，隨后若再度上升或超出以前水平，則提示病毒發(fā)生變異。

8 腫瘤基因檢測：盡管腫瘤發(fā)病的機理尚未清楚，但相關(guān)基因發(fā)生突變是致癌性轉變的根本原因已被廣泛接受。癌基因的表達增加和突變，在許多腫瘤早期就可以出現。實(shí)時(shí)熒光定量 PCR不但能有效地檢測到基因的突變，而且可以準確檢測癌基因的表達量。目前用此方法進(jìn)行過(guò)端粒酶hTERT基因、慢性粒細胞性白血病WT1基因、腫瘤 ER基因、前列腺癌PSM基因、腫瘤相關(guān)的病毒基因等多種基因的表達檢測。